Vương quốc Nấm là một thế giới đầy màu sắc và kỳ diệu, nơi mà các sinh vật và người dân sống hòa bình dưới sự bảo vệ của công chúa Peach. Nhưng hòa bình của vương quốc bỗng chốc bị đe dọa khi anh em thợ sửa ống nước Mario và Luigi vô tình bước vào một ống nước kỳ lạ và bị tách ra nhau. Luigi rơi vào tay quái vật tàn ác Bowser, người đang âm mưu xâm chiếm vương quốc. Bắt đầu cuộc hành trình cứu em trai, Mario bắt gặp anh bạn nấm hồn nhiên Toad và công chúa Peach, người mà Bowser đã bắt cóc. Với sự giúp đỡ của họ, Mario đã sẵn sàng đương đầu với mọi khó khăn và thử thách để ngăn chặn âm mưu đen tối của Bowser và đưa Luigi trở về an toàn. Đồng hành bên nhau, họ sẽ phải đối mặt với những quái vật dữ dội và vượt qua những thử thách nguy hiểm để bảo vệ hòa bình cho Vương quốc Nấm.